三級甲等綜合醫院國營
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1.病原學檢查由于真菌廣泛分布于自然界,甚至空氣中也常有孢子飛揚,采集糞標本和檢查操作中,應盡可能減少污染,標本要新鮮。有些真菌傳染性很強如莢膜組織胞漿菌,應注意安全防護,以免造成實驗室人員感染。
直接鏡檢標本
以10%氫氧化鉀或生理鹽水制片,高倍鏡下發現大量菌絲和孢子有診斷意義。對于雙相型真菌,僅查到孢子可能是正常帶菌。真菌性腸炎的6種常見病原多數情況下直接鏡檢即可鑒定,但孢子、菌絲和其他背景物質有時相互混淆,不易辨認。
①菌絲和孢子:菌絲粗細一致,除毛霉菌外均有分隔,可見不同角度的分支,細胞質均勻,內含大小不等的顆粒。孢子多為圓形或卵圓形,多數大小一致,邊緣整齊,可見細胞構造。
②細胞壁:在氫氧化鉀溶液處理的標本中,細胞壁常變寬,連接成弧狀,類似菌絲,但無菌絲的構造。
③石棉體:比菌絲更細,不分節,無菌絲顆粒。
④植物纖維:未消化的食物殘渣,邊緣不整,無分支。
⑤脂細胞:圓形,構造模糊,無細胞壁。
⑥磷脂小球:大小不一,形狀不整,無細胞構造。
⑦氫氧化鉀結晶:雪花樣或珊瑚狀,邊緣呈鋸齒形,折光性強。
⑧小水皰:圓形,透亮,無細胞構造。
染色鏡檢常用的染色方法
①革蘭染色:適用于念珠菌,孢子、菌絲染成藍色,但著色不均。
②過碘酸錫夫染色(PA5):真菌孢子、菌絲均染成紅色。
③丫啶橙染色:熒光顯微鏡下真菌孢子呈亮綠色。
④吉姆薩染色和瑞特染色:適用于莢膜組織胞漿菌,染色前用甲醇固定,油鏡下菌體染成紅色,較小一端有出芽,菌體周圍有一圈莢膜樣結構,為此菌的細胞壁。通常菌體位于巨噬細胞或單核細胞內,少數位于細胞外。
⑤乳酸酚棉藍染色:適用于各種真菌培養涂片,菌體染成藍色。
真菌培養
糞標本直接鏡檢通常不容易確定菌種,需參考糞培養結果,觀察菌落形態,再挑取菌落染色后鏡檢。常用沙保培養基和血瓊脂培養基。對于雙相型真菌還需在不同溫度下(25℃或37℃)分別培養,以便觀察其形態改變。
①大培養:是鑒別真菌的主要方法之一,可觀察菌落的生長情況。根據菌落的生長速度、形態、色澤等,初步判別菌種。
A.試管斜面:用白金環刺破瓊脂平面,分3點將標本接種于試管斜面培養基上。此法不易污染,但菌落較小。
B.培養皿:分3點將標本接種于平皿培養基中央,倒置后放恒溫箱中培養,每3天觀察1次菌落生長情況。
②小培養:將大培養中生長較好的菌落接種在玻片培養基上。培養1~3天后,在顯微鏡下觀察菌體的特征。
A.點片法:先將少許培養基成形于載玻片中央,再將菌種接種于培養基邊緣。覆以蓋玻片,置于有U形管的玻璃平皿中,培養后于不同時間取出鏡下觀察或染色鏡檢。
B.壓片法:將菌種接種在試管斜面或平皿培養基上,覆一蓋玻片,以便菌體向蓋玻片上生長,然后于適當時間取出置于載玻片上鏡檢。
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